makalah spektrofotometer

BAB I

PENDAHULUAN

Spektrofotometri merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombang spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube. Benda bercahaya seperti matahari atau bohlam listrik memancarkan spektrum yang lebar terdiri atas panjang gelombang. Panjang gelombang yang dikaitkan dengan cahaya tampak itu mampu mempengaruhi selaput pelangi mata manusia dan karenanya menimbulkan kesan subyektif akan ketampakan (vision). Dalam analisis secara spektrofotometri terdapat tiga daerah panjang gelombang elektromagnetik yang digunakan, yaitu daerah UV  (200 – 380 nm), daerah visible (380 – 700 nm), daerah inframerah (700 – 3000 nm) (Khopkar 1990).

Menurut Cairns (2009), spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Tiap media akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu tergantung pada senyawaan atau warna terbentuk.

BAB II

PEMBAHASAN

A.     Pengertian

Spektrofotometer merupakan alat yang digunakan untuk mengukur absorbansi dengan cara melewatkan cahaya dengan panjang gelombang tertentu pada suatu obyek kaca atau kuarsa yang disebut kuvet. Sebagian dari cahaya tersebut akan diserap dan sisanya akan dilewatkan. Nilai absorbansi dari cahaya yang dilewatkan akan sebanding dengan konsentrasi larutan di dalam kuvet.

Menurut Cairns (2009), spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Tiap media akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu tergantung pada senyawaan atau warna terbentuk. Secara garis besar spektrofotometer terdiri dari 4 bagian penting yaitu :

a.  Sumber Cahaya

Sebagai sumber cahaya pada spektrofotometer, haruslah memiliki pancaran radiasi yang stabil dan intensitasnya tinggi. Sumber energi cahaya yang biasa untuk daerah tampak, ultraviolet dekat, dan inframerah dekat adalah sebuah lampu pijar dengan kawat rambut terbuat dari wolfram (tungsten). Lampu ini mirip dengan bola lampu pijar biasa, daerah panjang gelombang (l ) adalah 350 – 2200 nanometer (nm).

b. Monokromator

Monokromator adalah alat yang berfungsi untuk menguraikan cahaya polikromatis menjadi beberapa komponen panjang gelombang tertentu

(monokromatis) yang bebeda (terdispersi).

c. Cuvet

Cuvet spektrofotometer adalah suatu alat yang digunakan sebagai tempat contoh atau cuplikan yang akan dianalisis.  Cuvet biasanya terbuat dari kwars, plexigalass, kaca, plastic dengan bentuk tabung empat persegi panjang 1 x 1 cm dan tinggi 5 cm. Pada pengukuran di daerah UV dipakai cuvet kwarsa atau plexiglass, sedangkan cuvet dari kaca tidak dapat dipakai sebab kaca mengabsorbsi sinar UV. Semua macam cuvet dapat dipakai untuk pengukuran di daerah sinar tampak (visible).

d. Detektor

Peranan detektor penerima adalah memberikan respon terhadap cahaya pada berbagai panjang gelombang. Detektor akan mengubah cahaya menjadi sinyal listrik yang selanjutnya akan ditampilkan oleh penampil data dalam bentuk jarum penunjuk atau angka digital.

Dengan mengukur transmitans larutan sampel, dimungkinkan untuk menentukan konsentrasinya dengan menggunakan hukum Lambert-Beer. Spektrofotometer akan mengukur intensitas cahaya melewati sampel (I), dan membandingkan ke intensitas cahaya sebelum melewati sampel (Io). Rasio  disebut transmittance, dan biasanya dinyatakan dalam persentase (% T) sehingga bisa dihitung besar absorban (A) dengan rumus A = -log %T (Underwood 2002)

B.  Jenis Spektrofotometer

Secara umum spektrofotometri dibedakan menjadi empat macam, yaitu :

a)      spektrofotometer ultraviolet

b)      spektrofotometer sinar tampak

c)      spektrofotometer infra merah

d)     spektrofotometer serapan atom

(Hadi 2009).

Dari 4 jenis spektrofotometer ini memiliki prinsip kerja yang sama yaitu “adanya interaksi antara materi dengan cahaya yang memiliki panjang gelombang tertentu”. Perbedaannya terletak pada panjang gelombang yang digunakan.

Secara sederhana Instrumen spektrofotometri yang disebut spektrofotometer terdiri dari :

sumber cahaya – monokromator – sel sampel – detektor – read out (pembaca).

C. Prosedur  Kerja Spektrofotometer

Spektrum elektromagnetik terdiri dari urutan gelombang dengan sifat-sifat yang berbeda. Kawasan gelombang penting di dalam penelitian biokimia adalah ultra lembayung (UV, 180-350 nm) dan tampak (VIS, 350-800 nm). Cahaya di dalam kawasan ini mempunyai energi yang cukup untuk mengeluarkan elektron valensi di dalam molekul tersebut (Keenan 1992).

Penyerapan sinar UV-Vis dibatasi pada sejumlah gugus fungsional atau gugus kromofor yang mengandung elektron valensi dengan tingkat eksutasi rendah. Tiga jenis elektron yang terlibat adalah sigma, phi, dan elektron bebas. Kromofor-kromofor organik seperto karbonil, alkena, azo, nitrat, dan karboksil mampu menyerap sinar ultraviolet dan sinar tampak. Panjang gelombang maksimumnya dapat berubah sesuai dengan pelarut yang digunakan. Auksokrom adalah gugus fungsional yang mempunyai elektron bebas nseperti hidroksil, metoksi, dan amina. Terkaitnya gugus kromofor akan mengakibatkan pergeseran pita absorpsi menuju ke panjang gelombang yang lebih besar dan disertai dengan peningkatan intensitas (Hart 2003).

Ketika cahaya melewati suatu larutan biomolekul, terjadi dua kemungkinan. Kemungkinan pertama adalah cahaya ditangkap dan kemungkinan kedua adalah cahaya discattering. Bila energi dari cahaya (foton) harus sesuai dengan perbedaan energi dasar dan energi eksitasi dari molekul tersebut. Proses inilah yang menjadi dasar pengukuran absorbansi dalam spektrofotometer (Aisyah 2009).

Cara kerja spektrofotometer dimulai dengan dihasilkannya cahaya monokromatik dari sumber sinar. Cahaya tersebut kemudian menuju ke kuvet (tempat sampel/sel). Banyaknya cahaya yang diteruskan maupun yang diserap oleh larutan akan dibaca oleh detektor yang kemudian menyampaikan ke layar pembaca (Hadi 2009)

Larutan yang akan diamati melalui spektrofotometer harus memiliki warna tertentu. Hal ini dilakukan supaya zat di dalam larutan lebih mudah menyerap energi cahaya yang diberikan. Secara kuantitatif, besarnya energi yang diserap oleh zat akan identik dengan jumlah zat di dalam larutan tersebut. Secara kualitatif, panjang gelombang dimana energi dapat diserap akan menunjukkan jenis zatnya (Cahyanto 2008).

a.      Tujuan Percobaan

Percobaan ini bertujuan untuk memahami prinsip penggunaan dari spektrofotometer, membuat kurva standar, dan menggunakannya untuk pengukuran sampel menggunakan spektrofotometer.

b.      Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam percobaan spektrofotometri ini adalah spektronik 20, kuvet, pipet volumetrik, bulb, gelas piala, tabung reaksi beserta raknya, dan gelas ukur. Bahan – bahan yang digunakan adalah akuades, larutan metilen biru (BM = 319.86 gr/mol), dan larutan sampel hasil pengenceran.

c.       Prosedur Percobaan

Praktikum ini terdiri dari tiga bagian, yaitu penentuan panjang gelombang dan pembuatan kurva standar. Pada percobaan penentuan panjang gelombang mula-mula disiapkan suatu larutan metilen biru (BM = 319.86 gr/mol) dengan konsentrasi antara 0.0001 M sampai 0.001 M masing-masing 10 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Selain iu disiapkan juga akuades sebanyak 10 ml di dalam tabung reaksi (larutan blanko). Setelah itu diambil lrarutan dengan konsentrasi tengah 6×10^-6 M. Larutan tersebut dimasukan ke dalam kuvet. Sebelum larutan metilen biru dimasukkan ke alam spektrofotometer, alat tersebut dikalibrasi dulu dengan akuades. Setelah dikalibrasi, kuver yang berisis larutan metilen biru 6×10^-5 M dimasukkan ke dalam spektrofotometer dan dilihat nilai transmitannya pada panjang gelombang 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, dan 680 nm. Setiap perubahan panjang gelombang yang digunakan, spektrofotometer dikalibrasi terlebih dahulu dengan akuades. Selanjutnya kurva hubungan antara absorban dan panjang gelombang dibuat berdasarkan data yang diperoleh. Panjang gelombang maksimum untuk larutan metilen biru ditentukan dari nilai absorban tertinggi pada kurva tersebut.

Percobaan kedua yaitu pembuatan kurva standar. Spektrofotometer yang akan digunakan diatur dengan panjang gelombang maksimum yang telah diperoleh pada percobaan pertama. Larutan metilen biru dengan berbagai konsentrasi yang telah disiapkan dimasukkan dimasukkan satu per satu ke dalam spektrofotometer dan dilihat nilai transmitannya. Setiap penggantian konsentrasi larutan, spektrofotometer dikalibrasi terlebih dahulu. Nilai transmitan yang telah diperoleh dikonversi menjadi absorban. Setelah itu dibuat kurva hubungan antara absorban dengan konsentrasi larutan metilen biru beserta persamaan garisnya.

d.      Hasil Percobaan

Tabel 1 Penentuan panjang gelombang metilen biru 6×10^-6 M

Panjang Gelombang (nm)	T	Absorbansi
600	90.1 %	0.0453
610	88.7 %	0.0521
620	88.2 %	0.0545
630	87.4 %	0.0585
640	86.7 %	0.0620
650	85.4 %	0.0685
660	85.3 %	0.0690
670	86.6 %	0.0625
680	91.6 %	0.0381

Keterangan : panjang gelombang maksimum adalah 660 nm

Contoh Perhitungan   :A  =  – log % T

= – log 0.901

= 0.0453

Gambar 2 Grafik Hubungan Panjang Gelombang dan Absorbansi

Tabel 2 Penentuan kurva standar dari metilen biru

[metilen biru] (M)	T (%)	Absorbansi
Blanko	100%	0
2×10-6	54.3%	0.2652
4×10-6	52.4%	0.2806
6×10-6	49.9%	0.3019
8×10-6	48.5%	0.3143
1×10‑5	48.2%	0.3169

Contoh Perhitungan : A  =  – log % T

= – log 0.543

= 0.2652

D. Prinsip Kerja Spektrofotometer

Prinsip kerja dari percobaan ini adalah menentukan konsentrasi sampel (metilen biru) dengan menggunakan kurva standar yang menghubungkan antara konsentrasi sampel dengan absorbansinya. Larutan biru metilen yang digunakan memiliki lima konsentrasi yang berbeda. Lima konsentrasi tersebut diukurnpanjang gelombangnya untuk mengetahui konsentrasi yang sebenarnya.

Metode analisa menggunakan spektrofotometer disebut spektrofotometri. Spektrofotometri merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombamg spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube. Benda bercahaya seperti matahari atau bohlam listrik memancarkan spektrum yang lebar terdiri atas panjang gelombang. Panjang gelombang yang dikaitkan dengan cahaya tampak itu mampu mempengaruhi selaput pelangi mata manusia dan karenanya menimbulkan kesan subyektif akan ketampakan (vision). Dalam analisis secara spektrofotometri terdapat tiga daerah panjang gelombang elektromagnetik yang digunakan, yaitu daerah UV  (200 – 380 nm), daerah visible (380 – 700 nm), daerah inframerah (700 – 3000 nm) (Khopkar 1990).

Metode ini dapat digunakan untuk mengetahui zat yang terkandung dalam makanan atau minuman seperti micro nutrient, zat pewarna, dll tergantung panjang gelombang yang telah disetting pada spektrofotometer. Setiap senyawa punya serapan maksimal pada panjang gelombang tertentu. Panjang gelombang ini dinamakan panjang gelombang maksimum. Pada panjang gelombang maksimum, hubungan antara absorbansi dan konsentrasi senyawa bisa disetarakan. Panjang gelombang maksimum dicari lebih dahulu supaya lebih mudah mengatur range panjang gelombang analisanya.

BAB III

PENUTUP

A.   Kesimpulan

Panjang gelombang yang digunakan adalah panjang gelombang maksimum, 650 nm. Hasil absorbansi biru metilen digunakan sebagai kurva standar yang menghubungkan konsentrasi dan absorbannya. Selanjutnya kurva standar digunakan untuk menghitung konsentrasi sampel yang belum diketahui konsentrasinya. Praktikan mampu menggunakan alat spektrofotometer, membuat kurva standard dan menghitung konsentrasi sampel. Sehingga Percobaan berhasil dilakukan.

B.      Saran

Dari makalah ini penulis mungkin memiliki kesalahan dalam penulisan makalah yaitu seperti dalam melakukan percobaan menggunakan spektrofotometer. Maka dari itu dalam melakukan analisis menggunakan Spektrofotometer harus dilakukan dengan prosedur penggunaan yang benar dan harus diperhatikan secara cermat dan teliti.